B6-Akt1tm1小鼠,动物试验

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基本信息

品系名称：B6-Akt1^tm1小鼠

英文名称：B6-Akt1^tm1 mice

疾病名称：糖尿病、癌症等

相关基因：NA

背景品系：C57BL/6J

遗传类型：基因敲除

繁殖方式：HOM X HOM

繁殖代数：NA

研究用途：糖尿病、癌症等、细胞生物学过程及信号转导方面的研究。

饲养环境：屏障或隔离环境

培育单位：北京华阜康生物科技股份有限公司、中国医学科学院医学实验动物研究所

保种单位：中国医学科学院医学实验动物研究所

资源鉴定：否

鉴定日期：暂无介绍

特征描述

 

 

蛋白激酶B又名Akt，分子量为56道尔顿，因其具有与蛋白激酶A与C的高度同源性而被命名为蛋白激酶B。随着小鼠胸腺瘤中的反转录病毒v—Akt的提纯，同源基因c—Akt也被发现，其编码的蛋白产物能使丝氨酸／苏氨酸磷酸化，称之为丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶Akt。研究发现，人类至少存在3种Akt家族成员：Aktl／PKBa、Akt2／PKBβ和Akt3／PKBγ．Aktl／2／3分别位于14号染色体短臂3区2带，19号染色体短臂l区3带和1号染色体短臂4区4带。Aktl和Akt2在人体的大脑、胸腺与心肺中广泛分布，水平较高，而Akt3则主要在人体的大脑和睾丸中表达，在心肺、脾和骨骼肌中水平较低，该3种异构体均有相似的催化功能域，可被第二信使调节，是细胞生长信号通路中的传感器，在生长因子或胰岛素介导的信号转导中扮演重要角色，在营养代谢、细胞生长、转录调控和细胞存活中也具有重要作用。

 

PKB结构

3种Akt的异构体都包含相同的保守功能域结构：N端的PH功能域，中间的激酶催化功能域和C端含疏水基序的调节功能域．PH功能域包括大约100个氨基酸，可与细胞膜上由P13K产生的PIP3的头基结合，并存在PDKl的结合位点，阻断这种结合会加重AGC激酶活化环的磷酸化。PKB的催化功能域在分子的中间区域，与PKC、P70S6K等AGC激酶高度相似，该功能域的氨基小叶中存在一个活化环，在活化环中的DFG和APE基序间有一个保守的苏氨酸残基308，该残基的磷酸化可部分激活PKB。所有PKB异构体C端均有一个约40个氨基酸的延伸片段，该区域含有疏水基序(hydrophobicmotif，HM)，人体PKB的HM序列为：苯丙氨酸／脯氨酸／谷氨酰胺／苯丙氨酸／丝氨酸／酪氨酸。当PKB的HM发生缺失突变时，Akt的酶活性会完全丧失，最新的研究表明，HM对于PKB的激酶催化活性具有变构调节作用，催化功能域的氨基小叶和αB螺旋、αC螺旋以及β—5片状结构形成一个疏水性的磷酸化袋状结构，HM通过与该结构的结合，增强催化功能域的稳定性，提高磷酸基团的转移率。

PKB的磷酸化调节

PKB含有2个特殊的磷酸化位点，Aktl的苏氨酸残基308位于激酶催化功能域的活化环上，而丝氨酸残基473则位于C端调节域中，Akt2的相应残基为苏氨酸309和丝氨酸474，而Akt3由于只有454个残基，其相应的残基位为苏氨酸305，PKB被IGF-1信号通路激活时，伴随着苏氨酸残基308和丝氨酸残基473的磷酸化，当使用P13K抑制剂时，残基的磷酸化和PKB的激活同时消失，当苏氨酸残基308和丝氨酸残基473发生丙氨酸突变时，PKB的活性下降85％一95％．而当苏氨酸残基308或丝氨酸残基473发生天冬氨酸突变时，PKB的活性可增大5倍．两者同时发生天冬氨酸突变时，PKB的活性可增大20倍，苏氨酸残基308发生单磷酸化时，若丝氨酸残基473未被磷酸化，C端小叶上的aB和C螺旋以及活化环会发生紊乱；若丝氨酸残基473发生天冬氨酸突变时，激酶催化功能域会从无序转化为有序，导致激酶催化功能域稳定在激活状态。苏氨酸残基308的磷酸化可部分活化PKB，丝氨酸残基473的单独磷酸化则对PKB的活性基本无效，但PKB的完全激活则需要丝氨酸残基473的磷酸化。苏氨酸残基308是被PDKl磷酸化的，但丝氨酸残基473的磷酸化则充满争议．理论上，丝氨酸残基473的磷酸化和苏氨酸残基308一样依赖于P13K，PDKl应成为丝氨酸残基473的磷酸化激酶，但敲除PDKl的ES细胞中丝氨酸残基473呈现出与野生型细胞相似的磷酸化，而苏氨酸残基308的磷酸化则完全消除．但过表达的PDKl可以增加丝氨酸残基473的磷酸化，表明PDKl可以间接增加丝氨酸残基473的磷酸化。有报道认为，在某种情况下PKB可以发生自磷酸化以及丝氨酸残基473被PDK2磷酸化，此外，ILK也与丝氨酸残基473的磷酸化相关，它可以磷酸化丝氨酸残基473，其抑制剂可以阻断PKB丝氨酸残基473的磷酸化，这些研究表明，ILK在丝氨酸残基473的激活过程中发挥作用，但能否直接磷酸化PKB则还充满争议，研究表明，酪氨酸磷酸化在PKB调节中发挥作用。PKB催化区域中的酪氨酸残基315和326可通过PKB C端的脯氨酸／X／X／脯氨酸模序(X为任意氨基酸)与Src分子C端的SH3功能域结合，导致磷酸化，在胰岛素和过钒酸钠作用下，酪氨酸残基474会被磷酸化，该残基突变为苯丙氨酸时，会减少苏氨酸残基308的磷酸化程度，使PKB活性下降55％。PKB的晶体结构显示，酪氨酸残基474参与HM与疏水袋结合的过程，酪氨酸残基474的芳香环与亮氨酸残基214相互作用，羟基与精氨酸残基207形成氢键结合。因此，当474突变后，HM与疏水袋亲和力下降，造成PKB的活性降低．而这也会降低PKDl与PKB的作用能力．丝氨酸残基473与酪氨酸残基474的磷酸化是互斥的，对磷酰氨基酸和胰蛋白多肽的分析显示，两者从不同时磷酸化，这提示磷酸化的丝氨酸残基474具有阻断残基473的作用，表明474残基的磷酸化可以抑制PKB的活性．由于这些酪氨酸在AGC激酶中普遍存在，这也可能是AGC蛋白家族的普遍调节机制。

PKB的上游物质

通常，PKB在没有受到外界刺激时一般以非活化形式在细胞质中表达，当存在IGF-1等刺激时，细胞膜上的受体酪氨酸激酶磷酸化，P13K信号通路激活，P13K是产生第二信使3、4、5三磷酸磷脂酰肌醇的关键酶，3、4、5三磷酸磷脂酰肌醇可与PKB的PH结构域结合，使PKB从细胞质异位至细胞膜，并发生构象改变，当存在P13K抑制剂或PH功能域缺失时，该异位被阻断。当PKB异位至细胞膜并发生构象改变后，PIP3可激活PDKl的活性，导致PDKl和PDK2磷酸化激酶催化功能域活化环上苏氨酸残基308和调节功能域丝氨酸残基473磷酸化以及余下的激活过程可被P13K的抑制剂渥曼青霉素和LY294002阻断。丝氨酸残基473的磷酸化是PKB激活的关键步骤，可稳定其活化状态，当丝氨酸残基473被磷酸化后，PKB从细胞膜进人细胞质或细胞核．此外，cAMP-PKA途径、钙调蛋白激酶和热休克蛋白27等可以独立激活PKB。

PKB的生理作用

PKB可以促进细胞增殖

p21及其相关家族成员p27可以通过可逆抑制一些周期素依赖激酶来阻断细胞周期，而PKB通过磷酸化p2l可以抑制细胞周期阻滞，表皮生长因子受体-2在乳腺癌和卵巢癌中过表达能激活PKB，PKB磷酸化p21的苏氨酸145残基．该过程本身不影响p21的抑制作用，但可以阻止p21进入细胞核，而p21必须在细胞核中才能发挥其抑制细胞增殖的作用。PKB还可以调节周期素依赖激酶抑制子p27的转录，激活的PKB或过表达的PKB可以降低p27在细胞中的水平，促进细胞增殖．此外，细胞周期进程的关键调节者还包括细胞周期蛋白(D1／D2／D3)，它可以刺激G1期，其需要细胞周期蛋白激酶4和细胞周期蛋白激酶6的活性．细胞周期蛋白受转录水平、翻译和蛋白稳定性控制，许多生长因子促进细胞周期蛋白的转录，P13K信号通路在此过程中扮演重要角色．过表达的P13K和PKB可以刺激细胞周期蛋白的翻译率。细胞周期蛋白水平受其从细胞核异位至细胞膜的影响，在细胞膜细胞周期蛋白1可被蛋白体的泛素化降解，其关键的步骤是由GS3磷酸化细胞周期蛋白l的苏氨酸残基286，这可以促进细胞周期蛋白1与核输出蛋白染色体区域维持蛋白1的结合，激活的PKB可以导致GS3的失活，降低GSK3对细胞周期蛋白1的磷酸化，保持细胞核中细胞周期蛋白l的较高水平。E2F是一种通用转录因子，控制多种DNA合成及细胞周期调节蛋白基因的转录，在细胞进入细胞周期前，E2F与袋状分子结合而处于无活性状态．当这些袋状蛋白在细胞周期蛋白和(或)细胞周期依赖性蛋白激酶磷酸化时，E2F被释放而得以发挥转录调节活性．PKB通过降低p27的表达，使袋状分子高度磷酸化，促进E2F的转录活性，使细胞从G1期进入s期。

PKB可以抑制细胞凋亡

血清和某些生长因子能抑制细胞的凋亡，但它们传递抗凋亡信号的机制尚不清楚。Kennedy等研究了5种生长因子的下游底物，Ras、Raf、Src、P13K和PKB的抑制凋亡能力发现，Ras、Raf和Src都不能传递存活信号，而P13K的抑制能促进凋亡，PKB的活化则能抑制凋亡。PKB可以通过抑制调节凋亡的蛋白来促进细胞生存，PKB的底物BAD可以通过与Bcl—x。的结合来促进凋亡，PKB磷酸化BAD可以使BAD与14—3—3蛋白结合，阻止其与Bcl-XL结合来抑制凋亡．叉头蛋白家族成员都含有Akt磷酸化的序列，可被Akt磷酸化．而磷酸化修饰可使叉头蛋白改变其细胞定位，在未被Akt磷酸化修饰时它们大部分定位于细胞核，促进凋亡相关基因Fas—L和Bim的转录，促进细胞凋亡．被Akt磷酸化活化后，它们从细胞核异位至细胞质与14-3-3蛋白结合，抑制细胞凋亡。此外，PKB还可以直接磷酸化并抑制caspase蛋白酶．大多数easpase具有PKB磷酸化位点，调节凋亡的关键酶caspase-9的磷酸化位点为丝氨酸196。PKB可以磷酸化caspase-9从而阻断内源性蛋白酶活性，在凋亡控制过程中发挥重要功能，过表达的活性PKB还可磷酸化凋亡信号调节激酶I的丝氨酸残基83，抑制其活性，并降低具有促凋亡作用的JNK活性。

PKB促进胰岛素信号应答

PKB是P13K的关键下游效应子，PKBβ在脂肪组织等胰岛素应答组织中高表达，是保证糖原正常合成的关键基因。PKBβ缺乏的小鼠表现出典型的Ⅱ型糖尿病特征，以及肝脏和肌肉出现胰岛素抵抗。随着胰岛素水平增高，胰岛的体积和数量发生显著增加。糖原合成酶激酶3在胰岛素刺激时可以磷酸化灭活糖原合成酶，该激酶是PKB的底物，GSK3a和β的磷酸化位点丝氨酸21和丝氨酸9均可被PKB磷酸化而失活，PKB的P13K依赖形式介导该过程，构成了胰岛素调节糖原合成信号通路中的重要旁路。研究表明，PKB磷酸化灭活GSK3后，可以导致肝脏和脂肪组织葡萄糖和氨基酸转化为糖原和蛋白质。PKB可以磷酸化激活脂肪组织中的cAMP-磷酸二酯酶3B丝氨酸残基273，导致磷酸二酯酶3B的激活，降低cAMP的活性以及PKA的活性，并调节细胞内环核苷酸的水平．心脏6-磷酸果糖激酶-2可被PKB磷酸化丝氨酸残基466，导致酶活性增高，促进糖酵解。葡萄糖运输蛋白4是胰岛素敏感的葡萄糖转运分子之一．在胰岛素的作用下，GluT4从胞浆向质膜移位。Akt可以促进葡萄搪的转运和葡萄糖运输蛋白4向质膜的移位，增加葡萄糖的运输，并可促进脂肪细胞的分化，其可能机制为当存在胰岛素等刺激因子时，PKB在细胞膜上被PDKl和PDK2完全活化，进入特定的葡萄糖运输蛋白4小泡中，促使其异位至细胞膜上，其他PKB的底物包括胰岛素受体底物1，它的磷酸化可以抑制P13K募集到细胞膜上，在胰岛素长期刺激时，在切断P13K活性的负反馈通路中具有重要作用。PKB的过表达在几个胰岛素反应细胞株中可以刺激营养的摄取如葡萄糖和氨基酸，并诱导其基因表达通常介导的胰岛素【1】。

PKB与肿瘤血管及侵袭性的关系

PKB与肿瘤血管生成的关系

PKB 可直接磷酸化和活化内皮型一氧化氮合酶( Endothelialnitric oxide synthase，e NOS)，活化的PKB 可以和 eNOS 共定位于细胞膜，促进新生血管的形成和 VEGF 导致的细胞迁移。eNOS 是心血管稳态的重要调节因子，它可以被 PKB 磷酸化丝氨酸-1177 位点而活化，诱导血管内皮细胞产生一氧化氮( NO)。PI3K- PKB- eNOS 信号转导通路被激活可产生大量 NO，NO 在调节血管张力、血管重塑、内皮生长和血管生成中起着至关重要的作用，PKB位于此通路的中心环节。Angiopoietin1( ANG1) 是一种促进血管内皮细胞的分化和血管新生的重要的血管生成因子，ANG1 可以通过激活 PI3K/PKB 的途径防止内皮细胞凋亡，还可以激活 eNOS。血管内皮生长因子可以诱发内皮细胞释放一氧化氮( NO)，释放的 NO 可上调某些细胞血管内皮生长因子 mRNA的表达，增强血管内皮生长因子的合成。内源性NO和VEGF 之间的良性互动，共同促进血管的生成。血管生成与肿瘤的发生、生长、转移、分期密切相关，参与肿瘤血管生成的因子中VEGF作用最强。eNOS、HIF 等对 VEGF 起调节作用的众多因子均与 PKB 活化密切相关，PKB 可能是调控 VEGF 表达通路中的关键蛋白，打断和抑制 PKB 通路，有可能抑制肿瘤血管的生成。有研究显示，PKB 在 VEGF 诱导的促血管生成作用中起着重要的调节作用，周晓东等研究表明，pAkt 蛋白可能促进胃癌的血管新生。

PKB与肿瘤细胞侵袭转移的关系

肿瘤的侵袭和转移是肿瘤细胞的恶性生物学行为，是一个多环节、多因素、多基因参与的复杂过程，也是临床绝大多数肿瘤患者致死的原因，因此研究肿瘤细胞侵袭及转移具有十分重要的临床意义。近年来研究表明 PI3K/AKT 信号通路在生长性的细胞迁移和癌细胞迁移中均发挥着重要作用，可促进肿瘤转移与侵袭。在哺乳类细胞中，PI3K/AKT 信号通路通过其下游的效应因子如 Rho，Racl 和 cdc42使细胞骨架重排，调节褶皱运动、细胞运动和细胞蔓延。PI3K/AKT 信号通路还可通过多种途径上调基质金属蛋白酶 2 ( matrix me tall oproteinase 2，MMP2) ，促进细胞侵袭。研究表明，PI3K/AKT 通路的活化使肿瘤细胞的迁移和侵袭能力增强，PI3K/AKT 通路抑制，可抑制细胞迁移与侵袭。Kobavashi等研究提示 pAKtser473蛋白的高表达可能参与促进胃癌细胞的侵袭转移。王艳丽等研究提示抑制此信号通路可以抑制胃癌细胞的转移、侵袭能力。这些研究结果均表明 PKB 与肿瘤细胞侵袭及转移相关【2】。

PBK与胃癌

PBK与胃癌Akt及pAkt蛋白特异性过表达于胃癌组织,可能是蛋白翻译水平和(或)代谢水平改变的结果。Akt蛋白的磷酸化可能促进胃癌细胞的恶性转化和淋巴结转移,VEGF-C可能在其中发挥重要的介导作用【3】。

PBK与糖尿病

葛根素可增加PKB表达并改善胰岛素抵抗,该作用可能与其增强胰岛素生物效应,减弱脂毒性对胰岛素信号通路抑制等机制有关【5】。PKB/Akt在几个水平上调控葡萄糖代谢。(1)通过影响葡萄糖转运蛋白 GLUT1、GLUT3 和 GLUT4 促进葡萄糖摄取。PKB/Akt诱导GLUT1 和 GLUT3 的表达, 以及 GLUT4 向质膜的移位, 此外, PKB/Akt 也可能通过增加内吞影响葡萄糖转运。(2)通过糖原合成酶激酶 3( GSK3)促进糖原合成。GSK- 3是第一个被发现的 PKB/Akt 的生理底物, PI3K、PDK、PKB/Akt 和 GSK3形成了胰岛调节糖原合成的信号级联系统中的一个重要支路。两种形式的GSK3的异构体GSK3α和GSK3β的氨基端都含有PKB/Akt的磷酸化位点, 胰岛素通过磷酸化和失活GSK3促进糖原合成。(3)通过磷酸果糖激酶 2(6- PF2- K)诱导糖酵解。PKB/Akt可以使心脏特异的6- PF2- KSer466发生磷酸化, 使其活化促进糖酵解【4】。

 

 

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注意事项

1.具体的试验周期以工程师告知的为准。

2.文章中的图片或者标准以及具体的试验方案仅供参考，因为每个样品和项目都有所不同，所以最终以工程师告知的为准。

3.关于（样品量）的需求，最好是先咨询我们的工程师确定，避免不必要的样品损失。

4.加急试验周期一般是五个工作日左右，部分样品有所差异

5.如果对于（B6-Akt1tm1小鼠,动物试验）还有什么疑问，可以咨询我们的工程师为您一一解答。