检测自噬金检测标准

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自噬检测金标准方法与流程详解

检测样品 自噬检测的常见样品包括体外培养的细胞系（如HeLa、HEK293、NIH/3T3等）、动物组织（如小鼠肝脏、脑组织）以及临床病理样本（如肿瘤组织切片）。样品的处理需根据实验目的进行预处理，例如饥饿诱导（使用EBSS缓冲液）、药物干预（如雷帕霉素或氯喹）或基因操作（如敲除自噬相关基因ATG5/ATG7）。

检测项目 自噬检测的核心项目包括：

1. 自噬体形成与降解水平：通过LC3-II/I蛋白比值、p62蛋白降解量评估自噬流活性。
2. 自噬体结构观察：直接观察自噬体的超微结构（如双层膜结构）。
3. 溶酶体与自噬体融合状态：检测自噬溶酶体的形成效率。

检测方法

1. Western Blot检测LC3与p62蛋白

   • 步骤：提取样品总蛋白，通过SDS-PAGE分离，转膜后使用抗LC3和p62一抗孵育，化学发光法显影。计算LC3-II与LC3-I的比值，p62蛋白的减少表明自噬降解活性增强。
   • 特点：定量分析自噬流的核心方法。

2. 透射电子显微镜（TEM）观察

   • 步骤：样品经戊二醛固定、锇酸后固定、环氧树脂包埋后制备超薄切片，染色后通过TEM观察自噬体结构。
   • 特点：形态学金标准，可直观显示自噬体双层膜结构。

3. mRFP-GFP-LC3双荧光标记法

   • 步骤：转染mRFP-GFP-LC3质粒至细胞，GFP在酸性溶酶体环境中淬灭，而mRFP信号稳定。通过共聚焦显微镜观察黄色斑点（自噬体）与红色斑点（自噬溶酶体）的比例。
   • 特点：动态监测自噬体-溶酶体融合过程。

检测仪器

1. 蛋白分析设备：

   • 电泳系统（如Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra）用于蛋白分离。
   • 化学发光成像仪（如Tanon 5200）用于Western Blot结果采集。

2. 显微镜设备：

   • 透射电子显微镜（如Hitachi HT7800）用于超微结构观察。
   • 激光共聚焦显微镜（如Zeiss LSM 880）用于荧光标记样品成像。

3. 细胞培养与处理设备：

   • CO2培养箱（如Thermo Scientific Heracell 150i）用于细胞培养。
   • 超速离心机（如Beckman Coulter Optima XPN）用于样品制备。

注意事项 实验需设立阴性对照（如自噬抑制剂氯喹处理组）和阳性对照（如饥饿诱导组），并严格控制样品处理时间与试剂浓度，避免假阳性结果。通过多方法联用可提高检测结果的可靠性。

本文提供的方法与标准广泛适用于基础研究与临床前试验，为自噬相关疾病机制探索及药物开发提供技术支持。

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实验仪器

测试流程

注意事项

1.具体的试验周期以工程师告知的为准。

2.文章中的图片或者标准以及具体的试验方案仅供参考，因为每个样品和项目都有所不同，所以最终以工程师告知的为准。

3.关于（样品量）的需求，最好是先咨询我们的工程师确定，避免不必要的样品损失。

4.加急试验周期一般是五个工作日左右，部分样品有所差异

5.如果对于（检测自噬金检测标准）还有什么疑问，可以咨询我们的工程师为您一一解答。