B6-Rnf128tm1小鼠,动物试验

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基本信息

品系名称：B6-Rnf128^tm1小鼠

英文名称：B6-Rnf128^tm1 mouse

疾病名称：传染性疾病、肿瘤

相关基因：Rnf128

背景品系：C57BL/6J

遗传类型：基因敲除

繁殖方式：HOM X HOM

繁殖代数：NA

研究用途：传染性疾病、肿瘤等及信号转导方面的研究。

饲养环境：屏障或隔离环境

培育单位：北京华阜康生物科技股份有限公司、中国医学科学院医学实验动物研究所

保种单位：中国医学科学院医学实验动物研究所

资源鉴定：否

鉴定日期：暂无介绍

特征描述

E3泛素连接酶RNFl28(GRAIL，gene related to anergyin lymphocytes)是一类在适应性免疫中发挥重要调节作用的蛋白。研究发现，RNFl28可以通过多种机制诱导CD4+T细胞失能。RNFl28通过泛素化作用不仅可以降解TCR-CD3(T细胞活化所需的第一信号)，还可以降解CD40L、CD83和CDl51(T细胞活化所需的第二信号及共刺激信号)，另外，RNFl28还可以可以降解T细胞与抗原提呈细胞(antigen—presenting cell，APC)接触时免疫突触形成的重要蛋白(Arp2／3和Coronin 1A)。大量的研究也证明，调节T细胞失能的其它几个E3泛素连接酶Cbl．b，c—Cbl和Itch都可以参与天然抗病毒反应。但是RNFl28在固有免疫反应中是否发挥作用还未见报道。

山东大学学者通过研究报道了RNF128最新研究结论：

病毒感染后诱导Rnf128表达上调

为了研究RNFl28是否在固有免疫信号通路中发挥作用，我们首先用poly(I：C)和ISD刺激小鼠原代巨噬细胞和人单核细胞THP一1细胞，发现RNFl28的mRNA和蛋白水平在刺激后都明显升高。类似的， RNA病毒SeV和DNA病毒HSV-1感染小鼠腹腔原代巨噬细胞和人TH-P1细胞也诱导RNFl28在mRNA和蛋白水平表达上调。

重组IFN．B刺激小鼠腹腔原代巨噬细胞后，RNFl28表达水平随着刺激时间的延长而不断升高；封闭了IFN—B受体的实验组在接受病毒诱导后，RNFl28的表达升高被抑制了；沉默了小鼠腹腔原代巨噬细胞中STATl和STAT2的表达，也明显抑制了SeV-或HSV-1病毒诱导的RNFl28表达升高。

RNFl28正调IRF3活性和IFN-β信号通路

由于病毒感染引起机体的一个主要效应就是诱导产生IFN-β，我们想进一步探讨RNFl28在IFN—β信号通路中的作用。在小鼠腹腔巨噬细胞和人THP-l细胞中的研究结果均显示通过siRNA沉默RNFl28后再分别转染Poly(I：C)、ISD或感染SeV、HSV-1，会显著抑制Poly(I：C)、ISD、SeV和HSV-1诱导的Ifnb1及下游相关ISG基因，包括CxcllO，Mxl和Ccl5表达水平，而不影响IL-6和Tnfa的表达。转染Poly(I：C)、ISD或感染SeV、HSV-1后，Rnf28—/一小鼠腹腔原代巨噬细胞中IFN-β的表达与分泌水平与WT组相比明显被抑制，IFN-β下游的Cxcll0，Mxl以及Ccl5基因的mRNA水平也显著低于WT组，而IL-6和Tnfa表达水平没有显著性差异。在HEK293细胞中我们发现RNFl28表达降低能够明显抑制TRIF信号通路以及DNA信号通路和RNA信号通路活化对IFN—β启动子及mRNA的影响。IFN—β的启动子区域有三个转录因子的结合位点，分别是IRF3， NF-KB和AP-1。分别结合到PRDII和IV区域， IRF3则结合到PRD I—III区域。RNFl28过表达能够增强TRIF-，MAVS和cGAS+STING诱导的IFN—β活性及PRDI—III报告基因活性，而对PRDII和IV的报告基因活性没有显著影响。说明RNFl28通过影响IRF3进而影响IFN—β的表达。

转录因子IRF3的磷酸化、二聚化以及入核是IRF3活化过程的三个必要步骤，活化的IRF3才能进一步结合到IFN-β的启动子区域，影响IFN—β的表达。我们分别向HEK293细胞中共转染RNFl28过表达载体以及TRIF-，MAVS和cGAS+STING过表达载体，检测IRF3的磷酸化，发现RNFl28过表达均能够增强上述信号通路活化引起的IRF3的磷酸化水平。我们进一步以野生型和RNFl28缺陷小鼠的腹腔原代巨噬细胞为研究对象，分别用SeV病毒和HSV-1病毒感染细胞，发现RNFl28缺陷组腹腔巨噬细胞的二聚化现象较野生组明显减弱。SeV病毒感染野生组腹腔巨噬细胞后，IRF3和P6均明显入核，而RNFl28缺陷组IRF3的入核明显受到了抑制，P65入核与对照组相比没有明显变化；同样HSV-1病毒感染后的结果类似。

RNFl28作用靶点为TBKl

以HEK293细胞为研究对象，共转染了RNFl28过表达质粒以及TRIF-，cGAS+STING-，RIG-IN-，MAVS-，TBKl-以及IRF3 5D过表达质粒，RNFl28过表达组与对照组相比，TRIF-，cGAS+STING-，RIG-IN-，MAVS-和TBKl．诱导的IFN—β表达和启动子活性均增强，但是对IRF3 5D诱导的IFN-β表达及报告基因活性没有影响；随后，我们又通过RNFl28特异性小干扰RNA沉默HEK293细胞中的RNFl28表达，同样转入TRIF-，cGAS+STING-，RIG-1N-，MAVS-，TBKl-以及IRF3 5D过表达质粒， RNFl28沉默降低了TRIF-，cGAS+STING-，RIG-IN-，MAVS-和TBKl-诱导的IFN—β表达及启动子活性，但是对IRF35D诱导的IFN—β表达和启动子活性没有影响。

免疫共沉淀实验(Co—IP)结果显示，RNFl28只能够与TBKl发生相互作用，而与其他接头分子没有相互作用。我们又通过免疫荧光实验进行了进一步验证。结果显示二者间存在微弱的共定位，当激活细胞病毒感染信号通路后，共定位现象明显增强。免疫荧光的结果与Co—IP结果一致。

RNFl28促进TBKl发生K63泛素化

向HKE293细胞中共转染Myc-TBKl、V5-RNFl28野生型和突变载体以及泛素化(Ub)表达载体，Co-IP结果显示RNFl28过表达确实能够增强TBKl的泛素化。体外的泛素化系统同样检测到TBKl的泛素化现象。向HEK293细胞中转入了RNFl28和TBKl的过表达质粒以及野生型(HA—Ub)和突变型的泛素化质粒，HA—ubiquitin-K48和HA—ubiquitin-K63，结果显示RNFl28过表达诱导TBKl的泛素化主要是K63位泛素化，而对TBKl K48位泛素化没有影响。而TBKl K30或K401位突变后，泛素化作用明显减弱，当这两个位点同时突变后，泛素化作用减弱更加明显。

RNFl28促进TBKl激酶活性

为了研究RNFl28介导的TBKl泛素化是否影响TBKl的活性，我们分别检测了WT和Rnf128-/-小鼠的腹腔巨噬细胞感染SeV病毒和HSV-1病毒后，TBKl激酶活性，发现Rnf128-/- 组的巨噬细胞感染病毒后TBKl激酶活性也明显低于WT组。在HEK293细胞中过表达RNFl28后再感染SeV病毒与对照组相比则显著增强TBKl激酶活性；而通过siRNA沉默RNFl28后再感染SeV病毒与对照组相比则显著抑制TBKl激酶活性。我们又以Tbkl-/-MEFs细胞为研究对象，通过电转分别转入Myc-TBKl-WT、 Myc-TBKl-K30R、Myc—TBKl一K401R和Myc．TBKl．K30R—K401R表达质粒。Myc—TBKl一WT转入组检测到显著的TBKl激酶活性以及TBKl磷酸化和励6J表达，而转入RNFl28过表达载体能够进一步增强TBKl磷酸化和Ifnb1表达，而TBKl-K30R、TBKl-K401R和TBKl-K30R-K401R转入组过表达RNFl28并不能增强TBKl磷酸化和 Ifnb1表达。

RNFl28调节TBKl活性具有普遍性

已有文献报道MIBl、MIB2和Nrdpl能够促进TBKl发生K63泛素化。为了研究MIBl、MIB2和Nrdpl的泛素化功能与RNFl28对TBKl活性调控的关系，我们分别设计了MIBl、MIB2和Nrdpl的siRNA，并转入Rnf128-/-的小鼠腹腔巨噬细胞中。LPS诱导后，siRNA沉默MIBl／MIB2组与对照组相比能够显著抑制SeV-诱导的砌6J表达以及IRF3和TBKl磷酸化，而LPS-或HSV-l-感染后则没有这种差异；siRNA沉默Nrdpl组与对照组相比能够显著抑制Ifnbl表达以及IRF3和TBKl磷酸化，而SeV-或HSV-1-感染后则没有这种差异。

RNFl28能够增强机体抗病毒能力

IFN—β的主要功能就是抗病毒感染，下面我们想继续探讨RNFl28对抗病毒功能的影响。我们以野生型和RNFl28缺陷小鼠的腹腔原代巨噬细胞为研究对象，分别感染了VSV和HSV-1病毒，通过空斑实验检测病毒滴度，结果显示RNFl28缺陷组不论被RNA病毒还是DNA病毒感染后，病毒滴度都比野生组显著升高。体外试验证明，RNFl28可以增强细胞的抗病毒能力，我们取野生型和RNFl28缺陷小鼠各3只，尾静脉注射VSV或HSV-1后检测血清中IFN—β的水平，发现不论是RNF病毒还是DNA病毒感染后，缺陷组血清中IFN—β水平都显著低于野生组；3天后，将小鼠处死，对VSV感染组，分别检测小鼠肝和肺中VSV病毒的滴度和复制，发现Rnf128-/-组显著高于wT组；对于HSV-1感染组，检测脑组织中HSV-1病毒的滴度和复制，同VSV组一样，缺陷组病毒滴度和复制水平较野生组组显著升高。致死实验发现RNFl28缺陷组小鼠，不管对VSV还是HSV-1，都更易被感染，生存率降低【1】。

RNF128与非小细胞肺癌 RNF128高表达促进NSCLC侵袭转移,其表达可能是NSCLC的一个新的预后预测指标及潜在的治疗靶点。

动物简介

营养成分

生物学特性

实验仪器

测试流程

注意事项

1.具体的试验周期以工程师告知的为准。

2.文章中的图片或者标准以及具体的试验方案仅供参考，因为每个样品和项目都有所不同，所以最终以工程师告知的为准。

3.关于（样品量）的需求，最好是先咨询我们的工程师确定，避免不必要的样品损失。

4.加急试验周期一般是五个工作日左右，部分样品有所差异

5.如果对于（B6-Rnf128tm1小鼠,动物试验）还有什么疑问，可以咨询我们的工程师为您一一解答。