技术概述

抑菌效力测定试验（Antimicrobial Effectiveness Test，AET），又称防腐效力试验、防腐挑战试验或微生物挑战试验，是一种通过人为向样品中接种已知数量的标准测试菌株，模拟产品在生产、储存和使用过程中可能受到微生物污染的情况，并在规定时间点测定存活菌数，从而定量评价样品中防腐体系或抑菌成分有效性的微生物学检测方法。

该试验的基本原理是：将新鲜培养的标准菌株悬液接种至待测样品中，使样品中的初始活菌浓度达到规定水平（通常为每毫升或每克10^5～10^6 CFU），然后将接种后的样品置于规定温度（一般为20～25℃）下避光保存，分别在第0天、第7天、第14天和第28天取样，采用平皿菌落计数法测定存活菌数，以初始活菌数的对数值与各时间点存活菌数的对数值之差（即lg下降值）来衡量样品的抑菌能力。lg下降值越大，说明防腐体系在相同时间内杀灭或抑制微生物的能力越强。

抑菌效力测定试验在国内外多个药典和标准中均有明确收载，例如《中国药典》四部通则“抑菌效力测定法”、美国药典（USP〈51〉Antimicrobial Effectiveness Testing）、欧洲药典（EP 5.1.3）以及化妆品领域的ISO 11930、CTFA/PCPC挑战试验方法等。不同标准在菌株选择、接种浓度、培养条件、取样时间点和判定限值上略有差异，检测时应根据产品的用途、销售区域和监管要求选择合适的标准执行。

试验中常用的五种标准菌株为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、白色念珠菌和黑曲霉，前三者代表细菌污染风险，后两者代表酵母菌和霉菌污染风险。判定标准通常按产品类别（如无菌制剂用、口服制剂用、局部用制剂等）设定不同的严格程度，一般要求细菌数在规定时间内下降不少于一定lg值且后续不再回升，真菌则要求呈明显下降趋势或不增殖。

检测样品

凡是添加了防腐体系或抑菌成分、且在生产和使用过程中容易受到微生物污染的多剂量产品，均可作为抑菌效力测定试验的检测对象。常见样品类型包括：

  • 药品类：多剂量包装的滴眼液、滴鼻液、糖浆剂、口服混悬剂、乳膏剂、凝胶剂、外用洗剂等含防腐剂的液体制剂和半固体制剂；
  • 化妆品类：爽肤水、精华液、膏霜、乳液、面膜、防晒霜、洗发水、护发素、沐浴露等；
  • 日化用品类：洗手液、洗衣液、湿巾、家居清洁剂等；
  • 医疗器械相关产品：超声耦合剂、器械润滑剂、隐形眼镜护理液等；
  • 其他：兽药制剂、功能性原料、保鲜类产品以及新型抑菌材料的防腐性能评价等。

送检样品一般要求包装完整、在保质期内，并尽可能代表实际生产批次的状态。对于开发中的新配方，可同时送检不同防腐方案的中试样品，通过平行比对筛选最优配方。

检测项目

围绕抑菌效力测定试验，可开展的检测与评价项目主要包括：

  • 细菌类抑菌效力测定：评价样品对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌等细菌的杀灭或抑制能力；
  • 真菌类抑菌效力测定：评价样品对白色念珠菌、黑曲霉等酵母菌和霉菌的抑制能力；
  • 单菌接种挑战试验与混合菌接种挑战试验：分别考察单一菌株污染和多种菌株联合污染情况下的防腐效果；
  • 重复挑战试验：对同一样品进行多次连续接种，模拟产品多次开启使用后的长期防腐能力；
  • 中和剂（灭活剂）验证试验：确认所用中和方法能否有效灭活样品中残留的防腐剂，保证计数结果真实可靠；
  • 存活菌数动态监测：对各时间点的活菌浓度进行测定并绘制变化曲线，全面反映防腐体系的动态作用过程。

检测方法

抑菌效力测定试验的典型流程包括以下几个环节：

第一，菌株活化与菌液制备。将标准菌株转接至适宜培养基上活化，细菌一般采用胰酪大豆胨培养基，于30～35℃培养18～24小时；真菌采用沙氏葡萄糖培养基，于20～25℃培养至适宜菌龄。用无菌稀释液将新鲜培养物稀释制成适宜浊度的菌悬液。

第二，样品接种。将各菌株的菌悬液分别接种至待测样品中，接种量通常控制在使样品中初始活菌浓度达到每毫升或每克10^5～10^6 CFU，同时接种体积一般不超过样品总体积的1%，以避免样品被过度稀释而影响防腐体系的真实表现。每个菌株设置独立的接种组，并保留未接种的阴性对照组。

第三，培养与保存。接种后的样品置于20～25℃、避光环境中保存，模拟产品在正常储存和使用条件下的状态。

第四，取样与活菌计数。于第0天（接种后尽快）、第7天、第14天和第28天分别从各接种组取样，采用含经验证中和剂的稀释液对样品进行梯度稀释，以平皿倾注法或涂布法接种于相应培养基平板，细菌平板置于30～35℃、真菌平板置于20～25℃培养规定时间后进行菌落计数。

第五，结果计算与判定。以lg下降值（初始活菌数的lg值减去各时间点存活菌数的lg值）作为评价指标，对照所执行标准中相应产品类别的限值要求进行判定。例如，多数标准要求细菌在14天内下降不少于3个lg值且28天时不再回升，真菌则要求下降不少于1个lg值或不增殖，具体限值以所执行标准的现行版本为准。

需要特别说明的是，当样品中含有防腐剂或其他抑菌成分时，必须先通过中和剂验证试验，证明所用的中和体系能够有效消除抑菌成分的残留活性，否则计数结果可能被低估或高估，导致结论失真。

检测仪器

抑菌效力测定试验涉及微生物培养、计数与无菌操作，常用仪器设备包括：

  • 二级生物安全柜或超净工作台，提供无菌操作环境；
  • 恒温培养箱，分别用于细菌（30～35℃）和真菌（20～25℃）的培养；
  • 高压蒸汽灭菌器，用于培养基、稀释液和器具的灭菌；
  • 菌落计数器，用于平板菌落的准确计数；
  • 光学显微镜，用于菌株形态确认与初步鉴别；
  • 电子天平、pH计，用于培养基配制与样品理化性质测定；
  • 涡旋混合器与均质器，用于菌悬液混匀和样品分散；
  • 微量移液器及配套无菌吸头，用于菌液接种与系列稀释；
  • 低温冰箱与普通冷藏冰箱，用于标准菌株与样品的保存；
  • 恒温水浴锅、离心机、比浊仪等辅助设备。

应用领域

抑菌效力测定试验的应用范围十分广泛，主要涵盖以下领域：

  • 制药行业：多剂量液体制剂、半固体制剂中防腐剂处方的有效性验证，产品注册申报资料的支持数据，以及防腐剂更换或工艺变更后的再评价；
  • 化妆品行业：新产品防腐体系设计与筛选、配方安全性评估、产品稳定性研究以及上市后质量监控；
  • 日化行业：洗涤用品、湿巾、家居清洁产品等防腐性能的确认与优化；
  • 医疗器械领域：接触人体的耦合剂、润滑剂、护理液等产品的微生物安全性评价；
  • 研发机构与高校：防腐机理研究、天然抑菌成分开发、包装形式对防腐效果影响等课题研究；
  • 质量控制与法规事务：为产品放行、标签宣称以及国际市场准入提供试验依据。

常见问题

问题一：抑菌效力测定试验的检测周期是多久？

抑菌效力测定试验一般为7-15个工作日。需要说明的是，由于试验本身包含第0天、第7天、第14天、第28天多个取样时间点，加上菌株活化、菌液制备、中和剂验证以及末次取样后的培养计数时间，完整试验周期通常需要四周以上。具体时长还会受到检测项目数量、样品数量、方法复杂程度以及是否需要加急处理等因素影响。例如，同时开展细菌和真菌全套试验、多配方平行比对时，工作量增大，周期会相应延长；若中和剂验证中发现干扰需要重新建立方法，也会额外增加时间。有加急需求的客户可与检测机构提前沟通，通过优先排产等方式适当压缩周期。

问题二：抑菌效力测定试验的检测价格是多少？

抑菌效力测定试验的价格受多种因素综合影响，无法一概而论。主要影响因素包括：检测项目的数量与范围（如仅测细菌类还是细菌、真菌全套测定）、所执行的标准与方法、平行设置的配方数量、样品数量、是否需要重复挑战试验或中和剂验证等附加项目，以及客户对检测周期的要求（常规周期与加急服务的费用不同）。此外，样品基质复杂程度也会影响前处理和计数的工作量，从而影响整体费用。建议在委托检测前，将产品详细信息、检测目的和具体需求告知检测机构，由专业人员评估后提供针对性的报价方案。

问题三：抑菌效力测定试验与微生物限度检查有什么区别？

两者目的不同。微生物限度检查是测定产品在出厂时实际含有的微生物数量和种类，回答的是“产品现在是否干净”的问题；而抑菌效力测定试验是人为向产品中接种大量标准菌株，考察产品中防腐体系在受到污染后能否杀灭或抑制微生物繁殖，回答的是“产品被污染后能否保持安全”的问题。前者属于常规放行检验项目，后者是对防腐配方设计有效性的验证，两者互为补充、不能相互替代。

问题四：抑菌效力测定试验为什么要进行中和剂验证？

样品中的防腐剂或抑菌成分在取样稀释后仍可能继续发挥抑菌作用，导致平板中的微生物在培养过程中被抑制甚至杀灭，使计数结果偏低，无法真实反映防腐体系的效果。中和剂验证的目的是确认所使用的稀释液或培养基中添加的中和物质（如卵磷脂、吐温80、组氨酸、硫代硫酸盐等的组合）能够有效中和样品中残留的抑菌活性，同时中和剂本身对测试菌株无毒性、不影响菌落正常生长。只有通过验证的中和体系才能用于正式试验，这是保证结果科学可信的关键环节。

问题五：抑菌效力测定试验在哪些时间点进行菌落计数？

按照药典方法的常规设计，接种后应尽快进行第0天计数（作为初始活菌浓度的基准），随后在第7天、第14天和第28天分别取样计数，用于计算各时间点相对于初始值的lg下降值，并观察菌数是否出现回升。部分化妆品挑战试验标准的时间点设置可能略有不同，也可根据研发需要增加第3天、第21天等中间时间点，以更细致地刻画防腐体系的动态杀菌曲线。具体时间点安排应以所执行标准的现行版本和试验方案为准。

问题六：如果抑菌效力测定试验结果不达标，应该怎么办？

结果不达标说明现有防腐体系不能在规定时间内有效控制微生物，需要从多方面排查和改进：一是复核防腐剂种类、用量及复配组合，评估是否存在协同增效的优化空间；二是检查配方的水分活度、pH值等关键参数，因为它们会显著影响防腐剂的活性形式；三是考察生产工艺和包装设计，如生产过程的微生物控制水平、包装的密封性与抗污染能力；四是确认试验环节是否存在技术干扰，例如中和剂失效、菌株活力异常等原因。建议与检测机构的技术人员共同分析数据，制定有针对性的配方优化方案后重新进行挑战验证，必要时采用重复挑战试验进一步确认改进效果。

问题七：进行抑菌效力测定试验对送检样品有什么要求？

送检样品应包装完整、状态正常且在有效期内，最好是能代表正式生产工艺的批次样品；研发阶段的中试样品也可送检，但应保证配方与工艺和后续放大生产一致。样品数量需满足每个菌株接种、各时间点取样计数以及可能的复测需求，一般建议每份配方提供足量样品，具体数量可在委托前与检测机构确认。样品在运输过程中应避免极端温度和挤压破损，膏霜类半固体样品应确保均匀性。此外，委托方还应提供产品的剂型、防腐剂组成、pH值、预期用途等基本信息，以便试验方设计科学合理的试验方案。