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自噬检测标准及技术流程

自噬（Autophagy）是细胞通过溶酶体降解受损细胞器或异常蛋白质的重要生理过程，其异常与癌症、神经退行性疾病等多种病理状态密切相关。准确检测自噬活性对研究其机制及疾病关联具有重要意义。本文依据国际自噬研究指南，总结自噬检测的核心标准与实验流程。

一、检测样品

自噬检测的常见样品类型包括：

1. 细胞系：如HeLa、HEK293、MEF（小鼠胚胎成纤维细胞）等，需通过饥饿处理（如EBSS培养基）或药物诱导（如雷帕霉素）激活自噬。
2. 动物组织：如小鼠肝脏、脑组织或肿瘤组织，需快速取材并冷冻保存以避免自噬水平变化。
3. 原代细胞：如神经元、肝细胞等，需在分离后立即处理以维持细胞活性。

二、检测项目

自噬检测的核心指标包括：

1. LC3-II/LC3-I比值：LC3蛋白的脂化形式（LC3-II）是自噬体形成的标志分子。
2. p62/SQSTM1蛋白水平：p62在自噬过程中被降解，其积累可反映自噬流受阻。
3. 自噬体数量：通过透射电镜直接观察双层膜结构的自噬体。
4. 自噬流动态：结合自噬诱导剂（如雷帕霉素）和抑制剂（如氯喹）分析自噬活性变化。

三、检测方法

1. Western Blot检测LC3与p62

• 步骤：
  • 细胞或组织裂解后提取总蛋白，定量后通过SDS-PAGE电泳分离。
  • 转膜至PVDF膜，使用抗LC3和抗p62一抗孵育，二抗标记后化学发光显影。
  • 计算LC3-II与LC3-I的比值，并分析p62蛋白的降解程度。

2. 免疫荧光观察LC3斑点

• 步骤：
  • 细胞固定后透化，用LC3抗体孵育，荧光二抗标记。
  • 共聚焦显微镜下观察LC3斑点的数量与分布（每个细胞斑点数＞5提示自噬激活）。

3. 透射电镜（TEM）观察自噬体

• 步骤：
  • 样品经戊二醛和锇酸双重固定，梯度脱水后包埋于环氧树脂。
  • 超薄切片（60-80 nm）染色后，透射电镜下观察自噬体结构。

4. 流式细胞术检测自噬流

• 步骤：
  • 使用荧光探针（如Cyto-ID）标记自噬囊泡，流式细胞仪定量荧光强度。
  • 结合氯喹处理验证自噬流的完整性。

四、检测仪器

1. 蛋白分析：垂直电泳系统（Bio-Rad）、半干转膜仪（Thermo Fisher）、化学发光成像仪（Azure Biosystems）。
2. 显微成像：激光共聚焦显微镜（Leica TCS SP8）、透射电子显微镜（Hitachi HT7800）。
3. 流式检测：流式细胞仪（BD FACSCelesta）。
4. 样品制备：超薄切片机（Leica UC7）、低温高速离心机（Eppendorf 5430R）。

结语

自噬检测需结合多种方法相互验证，以确保结果的可靠性。Western Blot与免疫荧光适用于常规筛选，透射电镜可提供形态学证据，而流式细胞术则支持高通量分析。实验设计需严格设置对照（如自噬抑制剂组），并遵循“自噬流动态分析”原则，避免单一指标的片面结论。

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实验仪器

测试流程

注意事项

1.具体的试验周期以工程师告知的为准。

2.文章中的图片或者标准以及具体的试验方案仅供参考，因为每个样品和项目都有所不同，所以最终以工程师告知的为准。

3.关于（样品量）的需求，最好是先咨询我们的工程师确定，避免不必要的样品损失。

4.加急试验周期一般是五个工作日左右，部分样品有所差异

5.如果对于（检测自噬的检测标准）还有什么疑问，可以咨询我们的工程师为您一一解答。