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流式细胞术检测细胞凋亡实验分析

检测样品

本实验的检测样品为体外培养的哺乳动物细胞系，包括人宫颈癌细胞（HeLa）、人肺癌细胞（A549）及小鼠成纤维细胞（NIH/3T3）。所有细胞均接种于含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中，在37℃、5% CO₂培养箱中扩增至对数生长期。实验组细胞经不同浓度化疗药物（如顺铂、紫杉醇）或紫外线辐射诱导凋亡，对照组为未经处理的正常细胞。收集细胞前，用胰酶消化后离心（1000 rpm，5分钟），PBS洗涤两次，最终重悬于预冷缓冲液中，冰上保存待测。

检测项目

1. 细胞凋亡比例分析：通过Annexin V-FITC/PI双染法区分早期凋亡（Annexin V⁺/PI⁻）与晚期凋亡或坏死（Annexin V⁺/PI⁺）细胞。
2. 线粒体膜电位变化：采用JC-1荧光探针检测线粒体膜电位下降，评估凋亡早期线粒体功能状态。
3. Caspase-3活性检测：使用FITC标记的Caspase-3抑制剂（FITC-DEVD-FMK）标记激活的Caspase-3，定量凋亡相关酶活性。
4. DNA断裂分析：通过TUNEL法（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记）检测凋亡细胞中DNA断裂情况。

检测方法

1. 样品制备：
   • 收集细胞后，用预冷PBS洗涤两次，调整细胞密度至1×10⁶/mL。
   • Annexin V-FITC/PI染色：取100 μL细胞悬液，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI染液（避光孵育15分钟）。
   • JC-1染色：按说明书比例加入JC-1工作液，37℃孵育20分钟后离心去除多余染料。
2. 流式细胞仪检测：
   • 上机前用300目滤网过滤细胞悬液，避免堵塞流式细胞仪喷嘴。
   • 设置FL1（FITC）和FL2（PE）通道检测Annexin V/PI信号，FL1/FL3通道分析JC-1单体（绿色）与聚合物（红色）荧光强度。
   • 每样本采集10,000个细胞信号，通过阈值排除碎片干扰。
3. 数据分析：
   • 使用FlowJo软件划分活细胞、早期凋亡及晚期凋亡细胞群，计算各象限细胞百分比。
   • JC-1实验以红绿荧光比值降低判定线粒体膜电位丧失。

检测仪器

1. 流式细胞仪：
   • 仪器型号：BD FACSCanto™ II（美国BD公司）
   • 配置参数：3激光（488 nm蓝激光、633 nm红激光、405 nm紫激光），8通道荧光检测系统。
   • 软件系统：BD FACSDiva™ 8.0.1，支持多色荧光补偿调节与实时数据采集。
2. 辅助设备：
   • 离心机：Eppendorf 5810R（德国Eppendorf公司），转速范围100-15,000 rpm。
   • 细胞培养箱：Thermo Scientific Heracell 150i，温度精度±0.2℃，CO₂浓度控制误差≤1%。
   • 荧光显微镜：Nikon Eclipse Ti2，用于预实验染色效果观察。

结论 流式细胞术可高效、多参数地定量细胞凋亡动态过程，结合特异性荧光探针与高灵敏度检测系统，为药物筛选、毒性评估及凋亡机制研究提供可靠数据支持。

实验仪器

测试流程

注意事项

1.具体的试验周期以工程师告知的为准。

2.文章中的图片或者标准以及具体的试验方案仅供参考，因为每个样品和项目都有所不同，所以最终以工程师告知的为准。

3.关于（样品量）的需求，最好是先咨询我们的工程师确定，避免不必要的样品损失。

4.加急试验周期一般是五个工作日左右，部分样品有所差异

5.如果对于（流式细胞检测细胞凋亡检测）还有什么疑问，可以咨询我们的工程师为您一一解答。