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B6-Cd1d1tm1小鼠,动物试验

原创发布者:北检院    发布时间:2023-02-28     点击数:

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基本信息

品系名称:B6-Cd1d1tm1小鼠

英文名称:B6-Cd1d1tm1 mouse

疾病名称:肿瘤、自身免疫疾病、炎症

相关基因:Cd1d1

背景品系:C57BL/6J

遗传类型:基因敲除

繁殖方式:HOM X HOM

繁殖代数:NA

研究用途:用于研究肿瘤、自身免疫疾病、炎症等及信号转导方面的研究。

饲养环境:屏障或隔离环境

培育单位:北京华阜康生物科技股份有限公司、中国医学科学院医学实验动物研究所

保种单位:中国医学科学院医学实验动物研究所

资源鉴定:

鉴定日期:暂无介绍

特征描述

传统观点认为,肽类抗原是引起 T 淋巴细胞免疫反应的唯一物质。然而近年来研究发现,脂类、糖脂类抗原也可通过 CD1d 介导特异性激活自然杀伤 T 细胞( NKT 细胞) 。CD1d 是 CD1 家族中的一员,在胸腺细胞、B 细胞亚群、表皮朗罕细胞、树突状细胞亚群、肠道上皮细胞中表达,是一类功能类似于 MHCⅠ类分子又独立于 MHCⅠ分子之外的具有抗原提呈作用的非多肽性跨膜糖蛋白分子。CD1d 分子激活NKT 细胞后具有抗肿瘤、抗病毒、抗病菌作用。因此,成为国内外学者研究热点。本文拟对 CD1d 分子的最新研究进展作一综述。

CD1d 的结构:

1、CD1d 的基因结构 人类 CD1d 基因位于 1 号染色体q22 ~ 23 区。小鼠 CD1d 基因位于 3 号染色体有 2 个同源基因 CD1d1 和 CD1d2,大鼠只有 1 个 CD1d 基因,三者高度同源。CD1d 基因有 5 个外显子和 6 个内含子,外显子编码: 胞内区、跨膜区、信号肽、a1、a2、a3 区。其组成形式与 MHCⅠ类基因相似,不同之处在于基因的两端: 5'端起始密码上游区序列 MHCⅠ类长度仅 18 bp,而 CD1d 却有 150 bp,这段序列很保守。在 3'端 CD1 基因的胞内区仅由 1 个外显子编码,而 MHCⅠ类基因由 3 个外显子编码【1】。有报道指出小鼠CD1d1编码基因1100bp,CD1d2编码基因1100bp,CD1d2基因编码大小为1008bp【2、3】。

2、CD1d 的分子结构 CD1d 分子的组成包括非糖基化和糖基化两种,后者是由 β2 微球蛋白( β2m) 与 CD1d 分子以非共价键形成的二聚体。CD1d 分子与 MHCⅠ类分子的结构相似,都包含胞外功能区( a1、a2、a3 区) 、跨膜区和胞内区。其中 a1 和 a2 区构成抗原结合域,它是由疏水性氨基酸组成的利于脂类分子与之结合的空穴样结构。与 MHCⅠ类分子比较,此抗原结合域位于 CD1d 分子胞外区的顶端,其沟槽结构较窄、较深、沟内面积较大,沟槽内面疏水性氨基酸残基较多,且在抗原结合槽中有 2 个大的疏水性口袋( A 和F) ,槽的两端是闭合的,与抗原结合要通过分子上部的一个窄口,这个入口从分子中心延伸到 F 口袋正上方的一点。这就决定了 CD1d 分子不能像 MHCⅠ类分子那样广泛形成氢键,容纳亲水性抗原。

CD1d 分子的提呈作用:

CD1d 分子能将装载完成的脂质抗原运送至细胞表面,并特异性提呈给 NKT 细胞,原结合位点开口狭窄,由非极性残基伸入 A' 和 F'口袋,用于容纳脂质抗原的 2 个疏水性脂质链,较长的酰基链锚定于 A'口袋,鞘氨醇链结合于 F'口袋,而亲水性糖基则突出于裂口处供 NKT 细胞识别。

1、CD1d 分子对内源性抗原胞内运输及提呈作用 内源性抗原是抗原提呈细胞内合成的抗原,CD1d 分子在内质网与 β2 微球蛋白组装形成复合物,此复合物可与内质网上的内源性脂质分子结合,形成 CD1d-抗原复合物,经过高尔基体运送到浆膜,此过程在时相上与分泌过程相同。再由接头蛋白( AP) 辅助从细胞表面运送至内体,此过程 CD1d 经胞吞作用先入被膜小窝,后入早期内体,再由 AP3 作用进入晚期内体或溶酶体。人类 CD1d 分子依靠其在胞质中的尾部酪氨酸模体结构进行内化,最后到达溶酶体。有研究显示,CD1d 分子的胞内运行及抗原提呈受 MHCⅡ类分子、组织蛋白酶 L、组织蛋白酶 S、恒定链的影响。THIERRY 等研究发现,CD1d 能识别多种内源性抗原,并以相同的方式提呈给 NKT 细胞表面 TCR。从而激发 NKT 细胞产生免疫反应。

2、CD1d 分子对外源性抗原的加工、装载及提呈作用 早期对 CD1 的研究主要集中在其识别结核分枝杆菌脂类抗原,如葡萄糖单霉菌酸脂( glucose monomycolate) 、阿糖甘露聚糖脂衍生物( lipoarabinomannan,LAM) 、结合环脂酸( mycolic acid) 等,并认为 CD1 只能识别脂类抗原。但随着对α-半乳糖基神经酰胺( alpha-galactosylceramide,α- GalCer) 研究的深入,改变了这一观点。α-GalCer 是一种从海绵中提取的能特异结合 CD1d 分子的外源性糖脂类抗原。其分子组成是由亲水性的碳水化合物与疏水性的酰基鞘胺醇,通过 α 连接形成的糖脂,分子质量为 800 000 左右。α-GalCer 反复刺激 NKT 细胞,能上调 IL-4 的表达水平,是功能强大的免疫调节剂,通过与 CD1d 分子结合后,特异性激活 NKT 细胞发挥免疫效应。但 糖脂类抗原在未经CD1d 加工处理前不能被 NKT 细胞所识别,CD1d 分子只有通过摄取后再加工,将α-GalCer 的末端糖基切除后才能被NKT 细胞识别。这一过程与 MHC 提呈肽类抗原相似。加工完毕的抗原要与 CD1d 结合,这一过程称为抗原的装载。由于 CD1d 分子的抗原结合槽位于面向溶酶体的亲水性腔室,故装载脂类抗原就需要由特异的脂质转运蛋白( LTP) 介导完成。在溶酶体和内质网中,介导装载 LTP 的种类也不相同。溶酶体中是由 GM2活化蛋白( GM2A) 介导。内质网中则是由三酰甘油转运蛋白( MTP) 介导装载,CD1d 装载内源性脂质抗原也是在 MTP 介 导 下 完 成 的。由于CD1d 能特异性地结合 α- GalCer 并提呈给 NKT 细胞,已有实验应用此原理,通过流式细胞仪检测 α-GalCer/CD1d 四聚体,从而测定 NKT 细胞的数量。

CD1d 分子特异性激活 NKT 细胞

NKT 细胞是不同于 T、B 淋巴细胞的第三类淋巴细胞,可直接杀伤某些肿瘤细胞和病毒感染细胞,故在机体抗肿瘤、早期抗病毒或胞内寄生菌感染的免疫应答中起重要作用。大量实验证明,NKT 是通过 Fas/FasL 途径、穿孔素途径以及 TNF -α 途径而发挥其直接抗肿瘤作用的。NKT 细胞的发育过程包含两个关键的调控点: NKT 细胞的选择分化和NKT 细胞的成熟。CD1d 分子是胸腺 NKT 细胞阳性选择过程中必需的抗原提呈分子,同时也可能介导了 NKT 细胞的成熟。NKT 细胞的抗原识别与传统的 T 细胞不同,不能识别由经典的 MHCⅠ、Ⅱ类分子提呈的抗原肽,而只识别由细胞表面 CD1d 分子提呈的脂类、蛋白质抗原,在这些抗原的刺激下 NKT 细胞被激活,并迅速地产生 IL-4、IFN -γ、IL-10、IL-13 等细胞因子,从而在抗肿瘤、抗感染、抑制自身免疫性疾病及移植免疫中发挥重要的作用。α- GalCer 是已知最有效的 NKT 细胞选择性抗原,常被用作 NKT 细胞的外源性激活剂,其科研及临床价值已得到广泛认可。

CD1d 分子激活NKT细胞后具有抗肿瘤及抗感染作用

CD1d 能特异性地将抗原提呈给 NKT 细胞,使其活化并分泌多种细胞因子,直接或间接参与机体免疫应答。这一原理已被用于对一些疾病进行治疗。国外学者的Ⅰ期临床实验表明,在晚期肺癌患者体内注射 α- GalCer 后NKT 细胞数量明显增加,从而起到抗肿瘤的作用。HBV 或HCV 感染者的肝脏组织出现 CD1d 表达上调的现象,而正常人肝脏的 CD1d 处于低表达状态。柯萨奇病毒感染心肌细胞后,原本不表达 CD1d 的心肌细胞也出现高表达。RAGHURAMAN 等认为,CD1d 的表达对于激活 NKT 细胞是必要的,并认为这一表达在感染时被调节,但机制尚不清楚。这些都提示了 CD1d 能介导 NKT 细胞产生抗肿瘤、抗病毒、抗细菌感染的作用。

CD1d 分子与自身免疫疾病

某些特殊自身免疫疾病患者的 CD1d 表达呈上调状态,这会促进 CD1d 对自身内源性脂质抗原的提呈,进一步激活NKT 细胞参与病理性免疫应答。有学者在类风湿关节炎患者体内检测到低水平、可溶性的 CD1d。另外 CD1d 基因被敲除的 MRL- lpr/lpr 小鼠,患系统性红斑狼疮( SLE) 的概率和病情均比野生型高。获得性免疫缺陷综合征( AIDS) 患者体内 CD1d 明显比正常人低,可能与患者免疫系统受损有关。说明 CD1d 在维持自身免疫稳定发面起到重要作用,但具体机制还有待进一步研究。可见,CD1d 基因高表达是把双刃剑,既有抗肿瘤、抗病毒、抗细菌、维持机体免疫稳定的作用,又有诱发自身免疫疾病的可能。目前 α- GalCer/CD1d 四聚体测定 NKT 细胞数量已得到应用,已有Ⅰ期临床实验利用体内注射 α-GalCer 来进行抗肿瘤治疗。这些都是以 NKT 细胞识别 CD1d 分子提呈的特异性外源抗原 α-GalCer 为理论基础的。因此,发 现CD1d 分子新的配体成为研究 NKT 细胞激活剂的有效途径,而新激活剂的发现,也会丰富肿瘤免疫治疗药物的种类。可见以 CD1d 为桥梁,进行免疫通路上下游的研究,不仅有理论意义,更有值得期待的临床价值。

CD1d分子与肿瘤

在移植瘤模型中,我们发现树突状细胞(DCs)是主要表达 CD1d 的免疫细胞,并且荷瘤小鼠的 DCs 相较于正常小鼠进一步上调表达CD1d。而给予 CD1d 敲除鼠荷瘤后,发现缺乏 CD1d 的表达可促进肿瘤生长。机制研究发现,CD1d + DCs 相较于 CD1d – DCs 上调表达共刺激分子 CD80 / CD86 和 MHC-II 分子,对 NKT 细胞具有更强的活化作用。进一步实验发现,过继转输 CD1d + DCs 可促进 NKT 细胞的抗肿瘤作用,从而抑制肿瘤生长。因此,我们的研究证实,CD1d 在炎症和肿瘤中均发挥重要的调控作用,但作用方式不同,CD1d 表达在不同种类的细胞可能发挥相反的生物学效应【5】。

 

动物简介

CD1d 是 CD1 家族中的一员,其结构类似MHC I 类分子,主要表达于抗原提呈细胞、肝细胞和肠道上皮细胞等细胞表面。CD1d 分子提呈糖脂抗原,在抗原装载、胞内运输及其加工处理等方面独具特色,并在感染性疾病、自身免疫性疾病和肿瘤等疾病的发生发展过程中具有重要作用。人CD1d基因位于第1号染色体上,而小鼠有2个CD1d 基因(CDld1 和 CD1d2),位于第 3 号染色体上,两者的同源性在 95%以上。

营养成分

饲料营养成分:水分≤10%;粗蛋白≥20%;粗脂肪≥4%;粗纤维≤5%;粗灰分≤8%;钙1.0-1.8%;磷0.6-1.2%。

生物学特性

生长曲线:无寿命:1-2年解剖学:无繁殖学:近交繁殖自发异常:无生理生化指标:无

遗传信息

根据目标基因Cd1d1的蛋白保守区和基因组结构,exon2(aa22-111)为公共exon,位于保守功能区:MHC-I-3。因此在这里形成移码突变,Cd1d1所有转录产物都发生移码突变,达到蛋白功能失活的目的。因此CRISPR设计靶点将设计在转录产物Cd1d1-001的exon2上(下图中的红色箭头所指位置);

实验仪器

实验室仪器 实验室仪器 实验室仪器 实验室仪器

测试流程

B6-Cd1d1tm1小鼠流程

注意事项

1.具体的试验周期以工程师告知的为准。

2.文章中的图片或者标准以及具体的试验方案仅供参考,因为每个样品和项目都有所不同,所以最终以工程师告知的为准。

3.关于(样品量)的需求,最好是先咨询我们的工程师确定,避免不必要的样品损失。

4.加急试验周期一般是五个工作日左右,部分样品有所差异

5.如果对于(B6-Cd1d1tm1小鼠,动物试验)还有什么疑问,可以咨询我们的工程师为您一一解答。

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